Analyse der Funktion der nichtmuskulaeren schweren Myosinketten in glatten Muskelzellen

Item Type:	Thesis
Title:	Analyse der Funktion der nichtmuskulaeren schweren Myosinketten in glatten Muskelzellen
Creators Name:	Lamounier-Zepter, V.
Abstract:	Das Ziel dieser Studie war es, die Beteiligung der nichtmuskulaeren schweren Myosinketten an der Kontraktion der glatten Muskeln unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Als Versuchsmodell wurde die Harnblase von neugeborenen Wildtyp und transgenen Maeusen verwendet, bei denen das Gen fuer die glattmuskelspezifischen schweren Myosinketten durch 'Gene Targeting' funktionell eliminiert wurde (Knock-Out). Das Fehlen der Expression der glattmuskelspezifischen schweren Myosinketten wurde durch Elektrophorese und Immunfaerbung bestaetigt. Im Gegensatz dazu blieb die Expression der nichtmuskulaeren schweren Myosinketten unveraendert. Die mechanische Analyse des glatten Muskels wurde mit intakten Muskelpraeparaten aus der Harnblase durchgefuehrt. Das Muskelpraeparat wurde in KCl-Loesung oder mit Phorbolester stimuliert. Die Aktivierung mittels depolarisierender KCl-Loesung fuehrte bei neugeborenen Wildtyp Maeusen zuerst zu einer transienten Kontraktion (Phase 1) mit hoher Kraftentwicklung und maximaler Verkuerzungsgeschwindigkeit, und danach zu einer tonischen Kontraktion (Phase 2) mit niedrigerer Kraftentwicklung und maximaler Verkuerzungsgeschwindigkeit. Blasenpraeparate neugeborener Knock-Out Maeuse dagegen zeigten keine Phase 1, sondern nur eine tonische Kontraktion, die mit Wildtyp Maeusen vergleichbar war. Daher scheint nichtmuskulaeres Myosin an der tonischen Kontraktion des glatten Muskels beteiligt zu sein. Durch Stimulierung mit Phorbolester waren aehnliche tonische Muskelkontraktionen der Blasenpraeparate sowohl bei Wildtyp als auch bei Knock-Out Maeusen zu beobachten. Vermutlich wird also das nichtmuskulaere Myosin durch Stimulierung mit Phorbolester aktiviert. Intrazellulaere Filamente wurden durch Immunfluoreszenz mit einem spezifischen Antikoerper gegen nichtmuskulaere schwere Myosinketten in kultivierten primaeren glatten Muskelzellen untersucht. Dabei zeigten die Muskelzellen sowohl von Wildtyp als auch von Knock-Out Maeusen intrazellulaere dicke Myosinfilamente, was fuer die Beteiligung des nichtmuskulaeren Myosins an der glatten Muskelkontraktion spricht. Entsprechend wurden intrazellulaere Filamente mit einem Antikoerper gegen glattmuskelspezifische schwere Myosinketten in kultivierten primaeren glatten Muskelzellen untersucht. Wie erwartet, konnten nur in glatten Muskelzellen von Wildtyp Maeusen intrazellulaere Filamente nachgewiesen werden, nicht aber in denen von Knock-Out Maeusen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass nichtmuskulaeres Myosin zumindest an der tonischen Kontraktion glatter Muskelzellen beteiligt sein kann. [The aim of the present study was to investigate the involvement of non-muscle myosin heavy chain in smooth muscle contraction under physiological conditions. As an experimental model urinary bladder from neonatal wild-type mice as well as from neonatal mice with disrupted smooth muscle myosin heavy chain expression was used. This animal model was established through gene targeting technology, resulting in complete elimination of the expression of smooth muscle myosin heavy chains. The lack of expression of smooth muscle myosin heavy chains was confirmed by electrophoresis and immunoblotting. On the other hand, non-muscle myosin heavy chain expression remained normal, as verified by Western blot analysis. The mechanical analysis of smooth muscle was performed with intact urinary bladder preparations, stimulated using prolonged KCl depolarization or with phorbol ester. Prolonged activation by KCl depolarization of intact bladder preparations from wild-type neonatal mice produced an initial transient state (phase 1) of high force generation and maximal shortening velocity, followed by a sustained state (phase 2) with lower force generation and maximal shortening velocity. In contrast, bladder preparations from homozygous knockout neonatal mice did not exhibit phase 1, but phase 2 could be observed, i.e. a similar isometric force and maximal shortening velocity, compared to wild-type phase 2. Thus, non-muscle myosin appears to be recruited in the sustained phase of smooth muscle contraction during prolonged KCl depolarization in the animal model used. Upon stimulation with phorbol ester a similar sustained contraction was observed in both wild-type and knockout smooth muscle preparations. Therefore, non-muscle myosin may also be recruited during phorbol ester stimulation in both wild-type and knockout muscle preparations. The participation of non-muscle myosin in smooth muscle contraction was further supported by the finding of longitudinally arranged intracellular filaments in cultivated smooth muscle cells from both wild-type and knockout mice by immunofluorescence microscopy, using a specific antibody raised against non-muscle myosin heavy chain. In a similar way, smooth muscle myosin heavy chain structures were investigated in cultivated smooth muscle cells. As expected, longitudinally arranged intracellular filamentous structures of smooth muscle myosin were observed in wild-type smooth muscle cells, but not in smooth muscle cells from knockout mice. In conclusion, in neonatal smooth muscle the initial phase of contraction elicited by KCl depolarization is generated by smooth muscle myosin heavy chain recruitment. Upon prolonged KCl depolarization non-muscle myosin is recruited in the sustained phase of contraction, as well as upon stimulation with phorbol ester. Thus, it was possible, for the first time, to verify the involvement of the non-muscle myosin in smooth muscle contraction in vivo. The results of the present study contribute to the understanding of the regulatory mechanisms of smooth muscle contraction.]
Keywords:	Kontraktion, Contraction, glatter Muskel, Smooth muscle, nichtmuskulaeres Myosin, Non-muscle myosin heavy chain, glattmuskelspezifisches Myosin, Smooth muscle myosin heavy chain, Phorbolester, Phorbol ester
Publisher:	Humboldt-Universitaet zu Berlin
Number of Pages:	87
Date:	13 January 2003
Official Publication:	http://edoc.hu-berlin.de/docviews/abstract.php?lang=ger&id=10547

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